亮菌产漆酶的液体和固体发酵条件优化

摘要：为了探讨液体和固体发酵条件对亮菌（Armillariella tabescens）产漆酶的影响，采用正交试验对亮菌液体和固体发酵产漆酶培养基和培养条件进行筛选。供试亮菌在液体培养时产漆酶甚微，在培养基和培养条件优化后最高酶活为7.92 U/mL；固体发酵时在以葡萄糖浓度0.6%、稻草麦麸质量比3∶7、温度27 ℃、含水量65%、接种量11 mL/100 g培养时漆酶酶活可达3 496.7 U/g。固体发酵的酶活显著高于液体发酵，固体发酵更适宜亮菌产漆酶。

关键词：亮菌（Armillariella tabescens）；漆酶；液体发酵；固体发酵

中图分类号：TQ925 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）06-1410-05

漆酶（Laccase，EC1.10.3.2）是一种含铜的多酚氧化酶，与抗坏血酸氧化酶、血浆铜蓝蛋白和胞外胆红素氧化酶同属于铜蓝氧化酶（Blue multicupper oxidase）家族[1，2]。1883年，日本学者吉田（Yoshida）[3]首次从日本漆树（Rhus verniciflua）树汁中发现了一种可以使树漆迅速氧化、硬化的酶；1894年，这种酶被分离纯化，并被命名为漆酶[4]。多年来的研究证明，漆酶在自然界中分布于多种植物、真菌、少数昆虫和细菌中，尤其在白腐真菌系统中分布更为广泛，现已成为研究的热点。漆酶具有的独特功能使其具有巨大的生物利用潜能，如纸浆的去木质化、染料脱色、废水脱毒、食品加工和制药等[5]。

亮菌（Armillariella tabescens）又名假蜜环菌，因由柳树发光朽木分离出菌种，菌丝体在暗处有荧光，故称亮菌[6]。亮菌中含有亮菌甲素、乙素、丙素、氨基酸、多糖等多种化学成分。民间用亮菌治疗胆囊炎和传染性肝炎有显著效果，现代药理研究表明亮菌具有醒酒[7]、保肝[8]、防辐射[9]、增强免疫[10]和抗肿瘤[11]等多种功效。为此，在前期工作的基础上，以漆酶酶活为检测指标，对亮菌液体发酵和固体发酵产漆酶的条件进行了研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌种 亮菌（Armillariella tabescens）菌种由中国普通微生物菌种保藏管理中心提供，培养保存于浙江医药高等专科学校实验室。

1.1.2 主要试剂 ABTS[2，2′-联氮-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺盐]购自美国Sigma公司，愈创木酚购自上海晶纯试剂有限公司，其他试剂均为国产分析纯。

1.1.3 仪器与设备 TU-1810SPC型紫外可见分光光度计购自北京普析通用仪器有限公司，Biofuge Stratos冷冻离心机购自德国贺利氏公司，PHS-3C型pH计购自上海精科仪器有限公司，BCM-1000型生物净化工作台购自苏州净化设备有限公司，SPX智能型生化培养箱购自宁波江南仪器厂，BS124S型电子天平购自赛多利斯科学仪器有限公司，HH-2型恒温水浴锅购自国华电器有限公司，BSD-226SK型冰箱购自青岛海尔股份有限公司。

1.1.4 培养基 综合PDA固体培养基（%）：葡萄糖2.0、琼脂粉1.8、土豆汁20、MgSO4·7H2O 0.15、KH2PO4 0.3、VB1 0.005；液体种子培养基（1 L）：葡萄糖20 g、蛋白胨15 g、KH2PO4 5 g、MgSO4·7H2O 1 g、（NH4）2SO4 5 g、玉米粉20 g、pH 6.0；液体发酵正交试验培养基（1 L）[12]：小分子碳源、高分子碳源、无机氮源、有机氮源、CaCl2 1 g、KH2PO4 3 g、MgSO4 1 g、VB1 0.05 g、吐温-80 0.5 mL、微量元素8 mL、pH 6.0；液体发酵培养基微量元素（1L）：MnSO4·2H2O 0.5 g、NaCl 1 g、FeSO4·7H2O 0.1 g、ZnSO4·7H2O 0.1 g、CuSO4·5H2O 0.1 g、H3BO3 0.01 g；固体发酵正交试验培养基（%）：葡萄糖、碳源、氮源、水、（NH4）2SO4 0.5、CuSO4 0.03、CaCl2 0.47、KH2PO4 0.5、MgSO4 0.2、 VB1 0.005、pH 6.0。

1.2 方法

1.2.1 培养方法

1）斜面及平皿菌种培养。在无菌条件下接种斜面和平皿培养基，于26 ℃避光培养7 d，于4 ℃冰箱保存，备用。

2）种子液培养条件。250 mL三角瓶装100 mL种子液培养基，在无菌条件下用打孔器（直径0.5 cm）量取2块平皿培养基的菌丝块接种至种子液中，置于27 ℃摇床以120 r/min避光培养7 d。

3）液体发酵培养条件。将种子液按6%的体积比转接，培养条件除试验特定其余均与种子液培养条件相同，所有试验均重复3次。

4）固体发酵正交试验培养条件。将种子液按一定的体积质量比转接，在试验条件下避光静置30 d。

1.2.2 粗酶液的制备

1）液体发酵酶液的制备。从液体培养的第8天开始，每天定时取样2 mL，在4 ℃、8 000 r/min下离心10 min，上清液即为粗酶液。

2）固体培养基酶液的制备。将固体培养基按质量比1∶1加入去离子水、捣碎培养料并搅拌均匀，放置于4 ℃冰箱中浸泡24 h，用八层纱布过滤，然后将滤液于4 ℃、8 000 r/min下离心10 min，上清液即为粗酶液，于4 ℃冰箱保存备用。

1.2.3 漆酶酶活的测定 4 mL反应体系中含0.5 mmol/L的ABTS（反应底物）、0.1 mol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（pH 4.0）、1 mL稀释的粗酶液，于35 ℃反应5 min，在波长420 nm处测吸光度，取吸光度变化的线性部分。酶活定义：在一定条件下，每分钟催化1 μmol ABTS氧化所需的酶量为一个酶活单位，单位为U。酶活=△OD420 nm×稀释倍数×4 mL×106/（1 mL×△t×ε×1 cm）（ε为消光系数，ε=3.6×104 cm/（L·mol）。

1.2.4 亮菌产漆酶的液体发酵工艺

1）不同培养基组合对亮菌产漆酶的影响。对不同碳源和氮源组合进行L16（45）正交试验，试验因素与水平见表1，培养完成后测定亮菌漆酶酶活，分析不同培养基组合对亮菌产漆酶的影响。

2）不同培养基浓度对亮菌产漆酶的影响。在上一步试验得到的最优培养基组合基础上对培养基不同浓度进行L16（45）正交试验，试验因素与水平见表2。发酵完成后测漆酶酶活，分析不同培养基浓度对亮菌产漆酶的影响。

3）不同培养条件对亮菌产漆酶的影响。在优化培养基前提下分别对装液量、接种量、菌龄和培养时间进行L9（34）正交试验，试验因素与水平见表3。发酵结束后测漆酶酶活，分析不同培养条件对亮菌产漆酶的影响。

4）不同诱导剂对亮菌产漆酶的影响。在以上最佳培养基和培养条件下进行亮菌产漆酶诱导试验。试验设计4组，分别加入0.5 mmol/L愈创木酚、0.5 mmol/L吐温-80、0.5 mmol/L苯酚、0.2 g/L CuSO4作诱导产漆酶试验，平行试验3组，分析不同诱导剂对亮菌产漆酶的影响。

1.2.5 亮菌产漆酶固体发酵正交试验 选择葡萄糖浓度、稻草∶麦麸（m/m，下同）、温度、含水量、接种量5个因素进行L16（45）正交试验，试验因素与水平见表4。发酵完成后测定漆酶酶活，分析不同培养基及发酵条件对亮菌固体发酵产漆酶的影响。

2 结果与分析

2.1 亮菌产漆酶液体发酵结果

2.1.1 不同培养基组合对亮菌产漆酶的影响 碳源和氮源是影响亮菌菌丝生长和代谢的重要因素，也是合成漆酶的重要原料。试验分别以小分子碳源葡萄糖、蔗糖、麦芽糖，高分子碳源淀粉、玉米粉、麦麸，无机氮源硫酸铵、氯化铵、硝酸铵，有机氮源酵母浸膏、蛋白胨、黄豆粉组合为不同碳源和氮源，测定不同培养基组合对亮菌产漆酶的影响。试验取第10天发酵液的酶活进行分析，结果表明，极差为有机氮源﹥无机氮源﹥小分子碳源﹥高分子碳源，有机氮源是影响亮菌漆酶酶活的关键因素，其他3个因素也有一定的影响。由图1可知，该菌发酵产漆酶的最适条件组合为A1B1C1D1，即最适小分子碳源为葡萄糖，最适高分子碳源为淀粉，最适有机氮源为酵母浸膏，最适无机氮源为硫酸铵，该条件下产生的漆酶酶活为2.05 U/mL，较其他酶活不足1 U/mL的状况有显著提高。

2.1.2 不同培养基浓度对亮菌产漆酶的影响 在上一步试验得到的最优培养基组合基础上对培养基不同浓度进行正交试验，并取第10天酶液酶活进行极差分析。结果表明，极差为酵母浸膏浓度﹥硫酸铵浓度>葡萄糖浓度>淀粉浓度，酵母浸膏浓度是影响亮菌产漆酶的关键因素。由图2可知，亮菌漆酶酶活最高的浓度组合是A2B2C2D2或A2B4C2D2，进行补充试验比较，结果表明A2B2C2D2组合酶活较高，即在浓度组合葡萄糖5 g/L、淀粉15 g/L、硫酸铵2 g/L、酵母浸膏15 g/L下，亮菌漆酶酶活达4.97 U/mL。

2.1.3 不同培养条件对亮菌产漆酶的影响 在优化培养基的前提下分别对装液量、接种量、菌龄和培养时间进行正交试验，并对其结果进行极差分析。结果表明，极差为菌龄﹥接种量﹥培养时间﹥装液量，菌龄是影响亮菌产漆酶最重要的因素。由图3可知，亮菌液体发酵产漆酶的最优条件组合是A2B2C2D2，对该组合进行补充试验，结果表明，该组合是亮菌产漆酶的最优条件组合，即在装液量75 mL、接种量6%、菌龄7 d、培养时间10 d的条件下，亮菌漆酶酶活最优，达5.35 U/mL。

2.1.4 不同诱导剂对亮菌产漆酶的影响 在前面最佳培养基和培养条件下进行亮菌产漆酶诱导试验，以未添加诱导物的培养基作为空白对照，结果见表5。由表5可知，以愈创木酚为诱导剂时，酶活提高到1.480倍，吐温-80和CuSO4组几乎未变，苯酚组酶活相对减弱。总体上，诱导剂的加入使亮菌产漆酶并未大幅度地提高。

2.1.5 4次试验结果的比较 将亮菌液体发酵优化试验依次表示为试验1、试验2、试验3、试验4，并对各步最优漆酶酶活进行比较，结果见图4。由图4可知，漆酶酶活随着发酵条件的改善逐步提高，但最高酶活仍不理想。

2.2 亮菌产漆酶固体发酵正交试验结果

选择葡萄糖浓度、稻草∶麦麸、温度、含水量、接种量5个因素进行正交试验，并对其结果进行极差分析。结果表明，极差由大到小为稻草∶麦麸﹥接种量﹥含水量﹥葡萄糖浓度﹥温度，稻草∶麦麸是影响亮菌产漆酶的重要因素。由图5可知，最佳组合是A3B4C3D3E3。对该组合进行补充试验，结果表明，该组合是最优发酵产漆酶组合，即葡萄糖浓度0.6%、稻草∶麦麸3∶7、温度27 ℃、含水量65%、接种量11 mL/100 g，其他条件不变的情况下亮菌漆酶酶活可达3 496.7 U/g，比其他组合的最好酶活高出约1.7倍。

3 讨论

真菌发酵筛选优化培养基和培养条件的方法很多，如单因素试验、均匀试验、正交设计等。由于本试验亮菌发酵产漆酶的培养基和培养条件因素多，因素间的组合比较复杂，利用正交设计“均匀分散性和整齐可比性”的优点，可以更准确高效地筛选出最优发酵因素和组合。

3.1 漆酶的亮菌液体发酵生产

微生物培养基碳氮源一般由小分子碳源、高分子碳源、无机氮源和有机氮源组成，因此将这4部分分别作为影响因素，既考虑到了单个碳源和氮源的影响，又考虑到了这4个因素之间不同组合的影响，可使得到的优化培养基营养更为均衡，更有利于菌种的生长代谢。其次，在最优培养基组合基础上依次进行培养基浓度、培养条件正交试验，并进一步做了漆酶诱导试验。

结果发现优化后亮菌漆酶酶活虽然有提高，但提高幅度很小，液体发酵所产漆酶的最高酶活只有7.92 U/mL，其原因可能是：①该菌本身在液体状况下不具备良好的产漆酶的能力；②选择的液体发酵培养基不适宜，尤其表现在碳氮源的组合上。菌株发酵碳氮源选择具有强大的广泛性，本试验选择的碳氮源只局限在其中的几种，可能这几种都不是亮菌具有良好液体发酵产漆酶能力的原料，因此还需要不断尝试；③碳氮比例不合适。虽然这几种培养基菌体长势不错，但是菌体在生长阶段和代谢产物产生时期所需的碳氮比往往不一样，因此，这也是今后研究的重点；④漆酶有两种，一种是可诱导型漆酶，一种是组成型漆酶。在担子菌中，细胞外组成型漆酶的生产量是很低的。但是各种与木质素或木质素衍生物相关的芳香烃类和酚类化合物以及重金属都可以显著地提高漆酶的产量[5]，此试验只选了愈创木酚、吐温-80、苯酚、CuSO4作为诱导剂，具有很大的局限性，应加大诱导剂试验范围。

3.2 亮菌液体和固体发酵产漆酶能力的比较

以稻草、麦麸为主料优化亮菌固体发酵产漆酶培养条件后，亮菌漆酶酶活达3 496.7 U/g，以其为标准数值计算固体发酵每克干料产漆酶酶活和每克干料每天产漆酶酶活。结果表明，每天每克干料的产酶效率为492.89 U/g。以同样的方式计算亮菌液体发酵每克干料的酶活和每克干料的产酶效率，结果表明，每天每克干料的产酶效率为15.6 U/g，固体发酵的产酶效率是液体发酵产酶效率的31.6倍。本实验室曾以麦麸∶豆饼粉为8∶2进行培养，亮菌产漆酶酶活可达20 000 U/g左右，产酶效率更高[13]。综合培养料的价格等因素，液体发酵成本较高。试验结果表明固体发酵更适合亮菌产漆酶。

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