发光细菌法在农药污染毒性检测中的应用研究进展
时间：2022-10-29 来源：博通范文网 本文已影响 人 
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摘要发光细菌法具有反应快速灵敏、低价高效、对环境友好等特点，常用于环境污染监测。本文综述了发光细菌法在农药污染毒性检测领域的应用研究进展，重点介绍了费氏弧菌、青海弧菌、明亮发光杆菌在人工合成化学农药、生物农药单一毒性检测以及在重金属一农药联合污染毒性检测中的应用，并提出了发光细菌法在农药与其他多重污染物毒性检测中的应用前景。
关键词 发光细菌法;农药污染;毒性检测
中图分类号 TQ450.9
文献标识码 A
文章编号 1007-5739（2019）05-0121-04
1国内外农药污染现状
目前，世界上生产和使用的农药有几千种，生产上每年要使用约350万t的农药，并以10%左右的速度递增。其中，中国、美国、阿根廷占到了70%;仅中国就约占总量的50%，成为世界第一生产和出口大国。我国农药生产主要集中在江苏浙江、天津、山东等省（市），其中江苏、浙江的农药产量占全国总产量的1/3以上，农药使用量较大的是山东、江苏、广东、浙江等省。农药施用后，仅有30%左右附着于植物体上，或渗入植株体内残留下来，使粮、菜、水果等受到污染;其余70%左右散落在土壤上，或蒸发、散逸到空气中，或随雨水及农田排水流入河湖，污染水体和水生生物，经食物链最终进入人体，引起各种慢性或急性病害，严重危害人体健康。2015年以来，农业部开展化肥、农药使用量零增长行动，每年安排逾40亿元专项资金，坚持“产出来”“管出来"两手抓、两手硬，切实提高农产品质量安全水平，强化投人品管理，提升绿色生产水平。在加强农药、兽药等投入品生产销售管理的同时，进一步强化安全用药指导服务，有效控制残留超标，消除风险隐患。
2发光细菌的分类及其毒性检测原理
2.1发光细菌的分类
发光细菌是一种非致病性、能进行生物发光的细菌，多数为海生，与发光浮游生物相同，能引起海面发光。发光细菌有传统分类、系统分类、数值分类等几种不同的分类方法。目前，多以美国学者P.Baumann的分类方法进行划分，分为弧菌属、发光杆菌属和发光异短杆菌属"。
2.2发光细菌法毒性检测原理
正常条件下，发光细菌能发出肉眼可见荧光，响应波长为450-490nm。发光菌形态多种多样，但生理特性却非常相似，发光机理基本相同。发光细菌含有荧光素荧光酶ATP等发光要素，在有氧条件下由分子氧作用，胞内荧光酶催化，将还原态的黄素单核苷酸（FMNH2）、长链脂肪醛氧化为FMN、长链脂肪酸，同时释放出最大发光强度在波长为450～490nm处的可见蓝绿光。
当细胞活性升高、处于积极分裂状态时，其ATP含量高，发光强度增强;而毒性物质的存在会直接抑制参与发光反应的酶类活性，并抑制细胞内与发光反应有关的代谢过程，抑制发光，且毒性越強抑制效果越明显。在一定的试验条件下，发光细菌发光强度恒定，发光变化的程度与受试物的浓度在一定范围内呈相关关系，同时与该物质的毒性大小有关。大量的研究表明，用发光细菌检测毒性的结果与鱼类或小鼠毒性检测的结果相比，其一致性较好，对污染物或毒性物质的检测试验仅需15～60min，具有快速灵敏、低价高效、对环境友好等特点。对于能够干扰或破坏发光细菌呼吸、生长、新陈代谢等生理过程的任何有毒物质都可以根据发光强度的变化来测定，如重金属、CN-、农药、酚类化合物、抗生素等。目前，国内常用的3种发光细菌为明亮发光杆菌费氏弧菌、青海弧菌。其中，应用于农药污染毒性检测中的主要发光细菌种类见表1。
3发光细菌法在农药污染毒性检测中的应用
3.1在人工合成化学农药污染毒性检测中的应用
3.1.1杀虫剂。目前，中国杀虫剂市场正面临市场占比和使用量双降的态势，产品安全性环境友好性逐步提高，但杀虫剂的用量及其对环境的影响依然是农药中最大的种类。张欢等采用青海弧菌冻干粉对不同浓度农药敌敌畏溶液的毒性进行快速测试，试验结果表明，系统的稳定性、可重复性、准确性可达到甚至优于传统方法。袁东星等4通过激活冻干发光细菌粉对空心菜中6种有机磷农药乳剂（甲胺磷敌敌畏、辛硫磷、氧乐果、甲基异硫磷、水胺硫磷）进行检测，响应结果表明，发光强度与6种农药毒性均成负相关关系，检出限约为1mg/L，测定下限为3mg/L，响应曲线满足现场快速检测的要求。吴淑杭等以明亮发光杆菌T3变种作为毒性测试物种，研究了乐果、杀虫单等8种化学杀虫剂急性毒性，结果表明，在一定浓度范围内，不同杀虫剂对明亮发光杆菌的急性毒性不同，发光菌的相对发光率与杀虫剂浓度成极好的线性负相关;4种有机磷杀虫剂乙酰甲胺磷、乐果敌敌畏与敌百虫对明亮发光杆菌的ECo（15min）分别40.33、38.42、31.11、11.10mg/L，2种拟除虫菊酯类杀虫剂氰戊菊酯、高效氯氰菊酯ECso分别为23.56、14.63mg/L，哒螨灵和杀虫单ECo分别为18.32、2.72mg/L，相较而言，有机磷杀虫剂对发光菌的毒性更弱一些。修垒等6选取氯氰菊酯、敌敌畏2种农药作为污染检测物，利用青海弧菌Q67测定其对发光细菌的毒性影响，得出毒性大小为氯氰菊酯>敌敌畏，虽然测试菌种不同，但是2种农药对发光细菌的毒性大小与吴淑杭等研究结果相似。
在测试条件的研究方面，唐雪惠等叫以敌敌畏和氧化乐果为研究对象，采用以发光菌综合毒性检测技术为基础的在线毒性分析仪监测有机磷类农药对水体的水质毒性效果，结果表明，氧化乐果和敌敌畏均能引起明显的毒性反应，ECxo与ECso均为mg级，该在线毒性监测仪更适用于突发性高浓度特征污染物的水质预警。魏芳等8以明亮发光杆菌为菌种，以40%乐果乳剂为供试农药，不仅初步研究了农药毒性可检测的浓度范围及灵敏度，同时初步确定pH值为7条件下发光强度最强。
在土壤中农药的检测研究中，张建江等以明亮发光杆菌作为测试菌种，对土壤中敌百虫进行毒性测试得出发光菌的相对发光率与敌百虫的浓度成负相关。张胜田等1以典型有机氯农药氯丹为研究对象，重点研究了氯丹在不同理化性质土壤颗粒中的吸附特性及其对发光菌急性毒性的影响，研究结果表明，不同粒径的土壤颗粒对氯丹的吸附性能依次为黏粒（<2μm）≈粉粒（2～20μum）>粗砂（200～2000pum）>细砂（20～200μm），4种土壤颗粒浸出液对发光菌毒性与吸附能力成负相关，较大粒径（20～2000μm）土壤颗粒吸附氯丹后易于解吸，对发光菌的急性毒性最大。Jose Antonio等叫研究了2种废弃矿井土壤的农药流动性和渗滤液毒性，发现农药渗滤液对生物发光抑制的一般趋势不像金属浓度随时间降低，而且污染土壤经改良能轻微减轻对费氏弧菌的毒性，结果与农药淋出量减少趋势一致。农药污染土壞渗滤液的毒性评估可以为化学分析提供有价值的补充信息，但目前我国尚缺乏以发光细菌为试验对象对土壤中的有毒污染物进行测试的标准试验方法。
对于农药混合毒性检测，张瑾等2基于青海弧菌Q67的微板毒性分析法系统地考察了涕灭威、残杀威呋喃丹、灭多威和抗蚜威5种氨基甲酸酯类农药及其混合物的毒性相互作用。杨洁等吲以青海弧菌Q67冻干粉作为测试菌剂，快速检测杀虫单、乐果、敌百虫、乙酰甲胺磷、甲胺磷、高效氯氰菊酯、氰戊菊酯、敌敌畏ECso（15min）发现，农药混合后的毒性明显大于单一农药，且低浓度助溶剂DMSO对发光菌存在刺激发光作用。刘淑申等4在研究溴氰菊酯等多种农药混合物对青海弧菌的联合毒性试验也表明，所有剂量一反应关系均由Weibull函数有效描述。
3.1.2除草剂。近年来，除草剂的品种逐渐增多，使用增长率远高于杀虫剂和杀菌剂，约占农药产量的1/3。刘淑申等9选择蛋白核小球藻和青海弧菌Q67进行比较发现，3种除草剂（西咪替丁、溴马西林和六唑酮）对青海弧菌的毒性明显高于蛋白核小球菌，说明发光细菌法对农药毒性灵敏度较蛋白核小球菌高.而发光细菌的灵敏度也与测试菌种、试验条件有关，施玮等呵应用明亮发光杆菌考察五氯酚钠生物毒性，结果表明，由于明亮发光杆菌为海洋细菌，钙、镁离子更有利于增强其抵抗毒性的能力，五氯酚钠对其ECso值随着pH值和硬度的增加而增加。
杨洁等13将莎稗磷作用于青海弧菌Q67（15min）得到的剂量一效应拟合曲线表明，一定浓度范围内，青海弧菌Q67的相对发光强度与莎稗磷的浓度成线性负相关。吴淑杭等凹7研究也发现，明亮发光杆菌的相对发光率与二氯喹啉酸、莎稗磷浓度成负相关，但这2种除草剂对明亮发光杆菌的急性毒性不同：在一定浓度范围内，二氯喹啉酸与莎稗磷的ECo（15min）分别为11.88、21.19mg/L。Kahru等8对百草枯等13种农药的相对毒性研究得到类似的结论。朱向伟等吵对使用短期微板毒性分析评估暴露时间对三嗪类除草剂毒性的影响时发现，不同除草剂对青海弧菌长、短期毒性存在差异性，敌草净、西米替林长期毒性和短期毒性相似，威尔柏普罗米通、嗪草酮的长期毒性较短期毒性高，而氨基三嗪具有比较高的长期毒性。
对多种农药联合毒性的研究，李娟试验结果表明，供试农药对明亮发光杆菌T3变种的单一毒性均可由Weibull和Logit模型定量表征，在农药混合体系中加人阿特拉津和扑草净后，农药联合毒性特征表现为阿特拉津和马拉硫磷、扑草净和乙草胺间的拮抗作用及马拉硫磷阿特拉津、扑草净、乙草胺间的协同作用。Kahru等8通过测定香豆素、五氯苯酚和草甘膦作为单一物质和混合物的ECo发现，混合物中存在拮抗或协同毒性作用。以上研究同样也说明，由于与除草剂性质有关的协同或拮抗效应，除草剂混合物净毒性可能与单一农药的影响之和有很大不同。
3.1.3杀菌剂。吴淑杭等以以明亮发光杆菌T3变种作为测试物种，测得多菌灵、氟硅唑、恶霉灵、福美双、异稻瘟净和乙霉威6种杀菌剂ECso（15min）分别为12.92、19.24、37.90、0.1733.99、13.32mg/L。同时，对多菌灵+氟硅唑二元农药混合物的联合毒性和主因子作用研究结果表明，多菌灵、氟硅唑对明亮发光杆菌的毒性有显著的正效应，多菌灵+氟硅唑二元农药混合物以拮抗作用为主"。
杨洁等13利用青海弧菌Q67对嗯霜灵进行快速毒性检测，测得其ECxo（15min）为332.3mg/L，相对同试验组的有机磷农药毒性较小。熊昭娣等叫同样选取青海弧菌Q67作为受试生物，研究表明，22%多菌灵杀菌剂ECso为7.70mg/L，毒性较大。王娜以提高发光细菌急性生物毒性测试灵敏度和重现性为目的，选择不同类型的杀菌剂（甲霜灵、三氯异氰尿酸、盐酸土霉素、乙磷铝、敌锈钠、氟硅唑）对费氏弧菌、青海弧菌Q67进行毒性测试发现，以上杀菌剂对2种发光菌的ECso差别不大，但在低浓度范围内，费氏弧菌对毒性更灵敏，其中敌锈钠对青海弧菌没有急性毒性。
3.2在生物农药污染毒性检测中的应用
吴淑杭等可以明亮发光杆菌T3变种作为测试物种，测得阿维菌素与甲氨基阿维菌素ECo（15min）分别为8.04、12.74mg/L，毒性大于同试验组的敌百虫、哒螨灵等人工合成杀虫剂，而阿维菌素+甲氨基阿维菌素混合物以加和作用为主”。杨洁等叫以青海弧菌Q67测定甲氨基阿维菌素急性毒性，结果表明，其ECso（15min）为28.8mg/L，相对毒性大于同试验组的甲胺磷、莎稗磷等化学农药毒性，对青海弧菌Q67的毒性存在显著的剂量一效应关系。王家德等I2用明亮发光杆菌T3检测了井冈霉素对土壤微生物的生态效应，证实井冈霉素的毒性很小。
以上研究表明，不同生物农药对发光细菌的毒性有强有弱。可见，生物农药虽然是“天然的”，具有对环境友好的特性，但是自然产生的分子也可能具有极大的毒性。
3.3在重金属与农药联合污染毒性检测中的应用
在农业生产中，农药与重金属联合污染比较常见，因而发光细菌在重金属与农药联合污染毒性检测中的应用尤为重要。张亚旦叫通过青海弧菌检测多元重金属、农药以及三聚氰胺等其他毒物的毒性结果得出，混合液能在20min短时间内令发光抑制率显著升高，体现了发光细菌快速检测的灵敏性.李汝等I可以Zn2+、CrS+.Cu2+、马拉硫磷、百菌清等为研究对象，用费氏弧菌进行生物综合毒性检测，仅10、15min后就可制成明显的发光抑制曲线。可见，发光细菌在多元混合毒性快速应急检测中具有良好的應用研究前景。
仇爱锋等9研究克百威、镉和铜3种混合样品对费氏弧菌的急性毒性效应，并进行定性评价，结果表明，克百威、镉、铜的二元与三元混合体系在不同混合比例下的联合毒性效应主要表现为相加作用和协同作用，为重金属和农药复合污染的生态风险评估提供了一定的数据支持。董欣琦I！”研究了PbCl一草甘膦～甲霜灵三元混合体系对青海弧菌Q67联合毒性作用的时间特征，结果表明，该体系在不同暴露时间点的毒性相互作用并非加和，而是均为拮抗。宋晓青啊用青海弧菌Q67作为指示生物考察农药一重金属混合物的毒性变化规律，包括敌草净嗪草酮、苯嗪草酮西草净、扑灭通、环嗪酮草甘瞵磺草灵、百草敌敌草快除草定和敌敌畏12种农药及CdCl2*2.5H2O、Ni（NO3）2*6H20、CoSO4.7H2O、ZnSO4.7H2O、HgCl、Fe（NO3）3*9H2O、MnCl2.4H2O和CuSO4.5H2O等8种重金属化合物对Q67的抑制毒性，发现该混合物对发光菌的毒性作用仍属于加和作用。刘祥9研究表明，甲霜灵与镉的不同比例复合污染对明亮发光杆菌的急性毒性均表现为拮抗作用。可见，发光细菌法能直接、全面地反映农药一重金属联合效应及其对环境的综合影响，但不同混合物种类对于不同种类发光菌的作用结果不一。
4展望
中国作为农业大国之一，具有广泛的耕地资源，具有各种土壤类型和各种土壤污染物。土壤成为农药的主要汇合库，为了确保农产品的质量，特别是在污染区域，有必要利用简便综合的检测方法进行生态安全性评估。综上所述，发光细菌综合毒性测试法在一定程度上弥补了传统理化监测法成本高、周期长、测试对象局限的缺点，发光细菌毒性可明确检测出农药一重金属复杂混合物的联合相关协同或拮抗效应，而且发光细菌技术可与紫外分光光度计、HPLC及GC/MS等大型分析仪器相结合，向着在线监测方向发展91。当然，由于海洋生物自身的特点，发光细菌法在环境中的应用存在一些缺陷;但随着菌种保藏技术的提高、基因工程发光菌的构建及固定化发光细菌光纤传感器的研制相关测试标准的制定，这些缺点将得到逐步克服，检测仪器的简便化与快速化，使得发光细菌在废水、污染土壤、空气综合污染毒性、食品残毒的评估等领域应用将会越来越广。
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