切花菊‘白扇’开放式组培快繁体系的建立

材料与方法

1.1  材料

‘白扇’原种植株由福建省尤溪县三叶花卉园艺有限公司八字桥种苗生产基地提供，取材前，植株喷施多菌灵一次，于次日晴天10：00左右，摘取长度15～20 cm的健壮、芽饱满、无病虫害的脚芽，剪除叶片，留下叶柄，装入自封袋，放4 ℃冰箱中保存备用。抑菌剂为山梨酸钾、代森锰锌和次氯酸钠，均购自上海生工生物技术服务有限公司，为普通分析纯试剂。

1.2  方法

1.2.1  外植体的消毒处理  用软毛刷轻轻刷洗‘白扇’枝条，切成长2～3 cm带有1～2个腋芽的茎段，流水冲洗30～60 min，再用500倍多菌灵溶液浸泡30 min，无菌水冲洗3次，转入烧杯中备用;将烧杯移至超净工作台，倒入75%酒精浸泡消毒30 s，倒去酒精，再用无菌水冲洗3次，倒去无菌水，转入无菌的烧杯，用不同浓度的次氯酸钠消毒10、15、20 min，不断振荡烧杯，倒去消毒液，用无菌水冲洗5次，转入无菌的接种盘，用接种刀将外植体切成带有一个腋芽的茎段，插入培养基，培养基为MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA;每个消毒处理接30瓶，每瓶接1个外植体，每处理3个重复;以0.1%升汞消毒5 min为对照;接种后25 d，统计外植体的污染率、成活率和芽生长情况。

1.2.2  开放式培养基的制备方法及配方  在干净的实验台面，将培养基中各种成份按顺序依次混合，加热至100 ℃左右煮沸，使蔗糖和琼脂完全溶解，搅拌混匀，在室温下缓慢降温至60 ℃左右，加入抑菌剂，充分搅拌均匀，用0.1 mol/L NaOH溶液调节pH至5.8～6.2，用100 ℃熱水定容至指定体积，搅拌混匀，将培养基均匀分装到洁净培养瓶中，不进行高压灭菌，冷却后备用。

开放式培养各阶段培养基的配方见表1。

1.2.3  开放式培养的接种及培养条件  接种条件：选择普通的接种室，先用75%酒精喷洒房间和接种台面，擦拭干净后，开启紫外灯照射0.5 h，通风10～15 min，接种器械始终浸泡在0.1%（V/V）次氯酸钠溶液中。

培养的条件：普通培养室，保持空气及地面洁净，温度（25±2）℃、光照强度2000 lx左右、光照时间12 h/d。

1.2.4  开放式初代培养  将按照1.2.1中的方法消毒处理过的带腋芽茎段，插入初代抑菌培养基中，每瓶一个外植体，每处理30瓶，3个重复，25 d后统计污染率、成活率、生长情况。对照组的培养基不添加抑菌剂，经1.1 kg/cm2压力和121 ℃下灭菌20 min，冷却后备用，在超净工作台中，按照严格的无菌操作方法接种，下同。

1.2.5  开放式继代培养  将2～3 cm长度的组培苗茎段接种到继代抑菌培养基中，每瓶接种3个材料，每处理30瓶，每处理3个重复，每10 d观察记录1次，接种后30 d统计污染率和增殖系数。

1.2.6  开放式生根培养  接种材料为继代增殖中长势好、长度约2 cm的无根苗，每瓶3株，每处理30瓶，每处理3个重复。每10 d观察记录1次，接种后30 d统计污染率、生根率、根数、根长等。

1.2.7  开放式移栽培养  取1.2.6中长良好、根系发达的组培苗100株，室温条件下炼苗2 d，取出轻轻洗去根部培养基，移栽到草炭土∶珍珠岩∶蛭石=2∶1∶1移栽基质中，遮阴条件下培养15 d，统计成活率及植株生长状况。对照组为常规组培方式培养的生根苗。

1.3  数据处理

生长情况包括芽长势、芽长、叶片颜色与大小等，采用Excel软件统计和SPSS 17.0软件对试验数据进行分析。

2  结果与分析

2.1  表面消毒剂浓度对常规初代培养污染率的影响

以‘白扇’带腋芽茎段为材料，用不同浓度次氯酸钠进行表面消毒处理，探讨浓度和消毒时间对切花菊‘白扇’常规初代培养效果的影响（表2），由表2可知，0.1%（V/V）次氯酸钠消毒10 min的组合，其污染率最高，显著高于其他组合与对照组（0.1%升汞消毒5 min），次氯酸钠各处理的污染率均与对照组无明显差异;0.5%（V/V）次氯酸钠消毒10、15、20 min和0.1%（V/V）次氯酸钠消毒10 min，它们的外植体成活率均极显著低于对照组，主要是0.5%（V/V）次氯酸钠浓度太高，消毒时间太长，对外植体的伤害大，导致成活率降低;0.1%（V/V）次氯酸钠消毒15、20 min，外植体的成活率分别为46.7%和43.3%，与对照组无显著差异，0.1%（V/V）次氯酸钠消毒15 min组合的芽长势比其中0.1%次氯酸钠消毒20 min的组合好，因此，‘白扇’常规初代培养的最佳表面消毒条件为0.1%（V/V）次氯酸钠消毒处理15 min。

2.2  抑菌剂对开放式初代培养效果的影响

在常规初代最佳培养基中添加不同种类和浓度的抑菌剂，探讨抑菌剂组合对开放式初代培养效果的影响（表3，图1），由表3可见，在污染率上，3、5、6、8、9号处理与其他处理具有极显著差异，且极显著高于对照组，其中3和9号处理污染率高达100%，主要是抑菌剂的浓度过低造成。1、2、4、7号处理与对照组的差异均不显著，其中，1、4、7号处理均低于对照组，4和7号处理最低，均为36.7%;在外植体生长上，与4号处理相比，7号处理的腋芽长势更好，芽更长，抽出的叶片更绿，且与对照组无明显差异。从表中R值可知，3种抑菌剂中，代森锰锌对污染率影响最大，其次是次氯酸钠，山梨酸钾影响最小;由K值可以确定理论上初代最佳抑菌剂浓度组合为：代森锰锌50 mg/L，次氯酸钠0.010%（V/V），山梨酸钾5 mg/L。该浓度既可以有效降低污染率，且不会影响诱导芽生长。

2.3  抑菌剂对开放式继代增殖效果的影响

在常规继代增殖最佳培养基中添加不同种类和浓度的抑菌剂，探讨不同抑菌剂组合对开放式继代增殖培养效果的影响（表4，图2）。从表中可知，增殖培养的污染率均随着抑菌剂浓度的升高而逐渐下降，增殖系数则呈现先增高后降低的趋势;从污染率来看，1和2号组合的污染率极显著高于其它组合与对照组（高压灭菌培养基与无菌操作接种），3、4、5和6组合与对照组没有显著差异，因此，代森锰锌浓度在30～60 mg/L范围内，即可达到较为有效的抑菌效果;从无菌苗的增殖情况来看，1、2和3号组合因污染率高，导致其增殖系数降低，均极显著低于对照组，在5和6号组合中增殖的无菌苗，因其抑菌剂浓度较高，生长较弱，分化芽少，芽短，导致增殖系数极显著低于对照组;从表4可以看出，4号处理组合的增殖系数为5.93%，显著高于其他组合，与对照组无显著差异，该处理的抑菌剂浓度较为合理，既可抑制污染，又不会对无菌苗的生长造成伤害。因此，‘白扇’开放式继代增殖培养基的最佳抑菌组合为4号组合，即添加5 mg/L山梨酸钾、40 mg/L代森锰锌和0.010%（V/V）次氯酸钠。

2.4  抑菌剂对开放式生根培养效果的影响

在常规生根最佳培养基中添加不同种类和浓度的抑菌剂，探讨不同抑菌剂组合对开放式生根培养效果的影响（表5，图3）。从污染情况来看，1和2号组合的污染率极显著高于其他组合与对照组（高压消毒培养基和无菌操作接种），主要是抑菌剂浓度过低造成;3、4、5和6号组合的污染率与对照组均无明显差异;生根率、根长和根数随抑菌剂浓度的增高呈现先增高后下降的趋势。从生根率来看，1、2、5和6号组合的生根率均极显著低于其他组合与对照组，主要是污染率过高和死亡率过高造成;3和4号组合的生根率极显著高于其他组合，但3号组合的生根率显著低于对照组，这是由于3号的抑菌剂浓度较低导致污染率较高，从而使生根率偏低;4号组合生根率为80%，与对照组无显著差异，这是因为该浓度既抑制了污染，又对无菌苗伤害较小;從根长来看，高浓度的代森锰锌影响很大，1、2、3、5、6号组合的根长均极显著低于对照组，主要是因为污染率和死亡率较高;4号组合的平均根长2.93 cm，与对照组无显著差异，该浓度抑菌效果最佳，且能促进根系生长;从生根数来看，1、2、5和6号组合的根数与其它组合和对照组均具有极显著差异，3号组合与对照组有显著差异，4号组合的平均根数为8.68根，与对照组无明显差异，该浓度既可有效抑制污染，且能促进生根。因此，‘白扇’开放式生根培养基中最佳的抑菌剂组合为4号，即在生根培养基中添加5 mg/L山梨酸钾、40 mg/L代森锰锌和0.010%（V/V）次氯酸钠。

2.5  抑菌剂对开放式移栽培养效果的影响

抑菌处理培养的生根苗的移栽情况见表6，由表中数据可知：开放式培养移栽苗的成活率为95%，对照组成活率为98%，差异不大，但是植株的生长状况有一定的差别，开放式移栽苗的叶片普遍稍小于对照组，但茎秆比对照组粗。

3  讨论

植物开放式组培的相关研究越来越热，日本已经广泛应用在多种观赏植物中[14]。其核心问题在于找到安全高效的外植体消毒剂以及高效稳定且不影响无菌苗生长的抑菌剂。

在常规组培中，多使用0.01%的升汞作为外植体消毒剂，虽然效果良好，但是该消毒剂毒性较大，回收不便，且易对环境造成污染。因此，在开放式组培中需要寻找低毒且高效的消毒剂。本研究采用次氯酸钠溶液对外植体消毒，具有安全低毒高效的杀毒效果。研究结果表明，0.1%（V/V）的次氯酸钠浸泡外植体15 min可有效对外植体进行消毒，且诱导芽生长情况与升汞消毒的诱导芽无明显差异，适宜作为外植体的表面消毒剂。

开放组培污染来源广泛，主要由细菌、真菌、酵母菌及放线菌等微生物引起[15]。在开放式初代培养中，污染主要来源于接种室的空气和地面、外植体本身、接种操作不当引起的污染以及培养基污染[16];继代增殖和生根培养阶段，主要是接种室的空气和地面、操作污染以及培养基污染[17]。针对不同阶段的污染来源，在开放式组培中，应当保持接种室干净无尘，外植体提前进行预处理[18]，培养基选择加入不同种类的抑菌剂，从而达到广泛而长效抑菌的效果。本研究中，在开放式培养各阶段加入不同种类不同浓度的抑菌剂，观察抑菌效果，结果显示，开放式培养中，抑菌剂的加入能够有效抑止培养基的污染，从整体来看，添加低浓度抑菌剂时污染率较高，显著高于常规培养，添加高浓度抑菌剂时污染率较低，但植株的生长会受到显著影响，主要表现为叶片发黄甚至枯萎。因此，开放组培需要找到既能降低污染率又不影响植株生长的抑菌剂浓度。

本研究选用的3种抑菌剂具有较为广泛的抑菌能力，其中，山梨酸钾是一类化学类酸性抗菌防腐剂，主要是通过抑制微生物体内的脱氢酶系统，达到抑制微生物生长的效果，对细菌、霉菌、酵母菌等微生物的生长均有抑制作用;代森锰锌在化学结构上属于二硫代氨基甲酸盐类杀菌剂，是一种广谱性杀菌剂，要害小，对细菌、真菌、酵母菌和藻类有效，作用机理是抑制硫基;次氯酸钠能够在水中分解出氧化性极强的氧负离子，能够与蛋白中的氨基结合而使其变性，从而起到杀菌作用[19]。因此可知，单一抑菌剂具有较为单一的抑菌效果，而不同的抑菌剂组合在一起使用，能取得较好的抑菌效果[20]。前人亦有使用这3种抑菌剂在开放式组培试验中，黄敏等[21]在铁皮石斛开放式培养时，添加不同浓度的代森锰锌到继代培养基中，探索最佳的抑菌浓度，结果表明，代森锰锌浓度为0.02%时，增殖系数高达2.68，且污染率较低;李松等[8]在研究中发现，甘蔗开放式培养基中次氯酸钠的最佳添加浓度为1 g/L，该浓度能够有效抑制污染，且甘蔗组培苗长势较好;解辉等[22]亦在香蕉开放式组培中发现，次氯酸钠具有较好的杀菌效果，能够有效抑制培养基污染;王丹等[11]在研究中指出，红豆杉开放式培养中，山梨酸钾能够取得较好的杀菌效果，且抑菌浓度为为0.02 g/L时，效果最佳。由此可见，抑菌剂在开放式组培中具有广阔的应用前景。

根据前人经验，在本试验中，将3种抑菌剂混合配成复合型抑菌剂，能够发挥各自的抑菌能力，从而能够达到广泛的抑菌效果。研究结果表明：在切花菊‘白扇’的初代培养中，培养基中添加代森锰锌50 mg/L，次氯酸钠0.010%（V/V），山梨酸钾5 mg/L，就可抑制组培污染，且腋芽生长状况与传统方式无明显差异;增殖继代和生根培养在培养基中加入5 mg/L山梨酸钾，40 mg/L代森锰锌，0.010%（V/V）次氯酸钠，可有效抑制污染，且组培苗的增殖系数、生根率与常规组培无明显差异。其中，代森锰锌浓度的变化对污染率和植株的生长影响最大。代森锰锌浓度从10 mg/L增加到60 mg/L时，增殖继代污染率从34.4%降低到4.4%，生根培养中污染率从34.4%降低到5.5%，而植株的长势皆则随着浓度的增高逐渐变差，主要表现为无菌苗叶片较小，发黄，根系发黑，较短。

开放式培养因在培养基中添加了抑菌剂，一定程度上会抑制细菌的生长，降低污染率，但因抑菌剂的加入，无菌苗的生长也在一定程度上受到了影响。本试验中，次氯酸钠能够分解氧负离子，从而与蛋白结合致使其失活，植株的叶片因此失绿，植株活力降低，无菌苗增殖数量略少于传统组培的无菌苗数量;根长较常规组培短，这可能由于抑菌剂的加入改变了培养基的pH，导致无菌苗无法有效吸收培养基中的NAA，使根系生长受到影响，前人的研究亦表明抑菌剂对无菌苗的生长有一定抑制[20， 23]，但抑菌机理的相关研究尚不完善。此外，开放式生根苗移栽苗的生长情况略差与对照组，可能是抑菌剂影响了植株的生长能力。因此，在切花菊开放组培中，如何减少抑菌剂对无菌苗的增殖、生根以及移栽影响，还需要后续的深入研究。

综合来看，本研究初步建立了切花菊‘白扇’开放式组培体系，操作方法简单有效，可根据具体情况，加以优化，便可应用于生产实践。

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