一种新的豇豆根腐病病原菌鉴定及室内药剂筛选

摘要 本文对四川成都发生的豇豆根腐病病原菌进行鉴定，为豇豆根腐病的药剂防治提供依据。采集了成都市豇豆种植区豇豆根腐病病株，经常规组织分离并纯化获得116株分离菌株，对分离菌株进行致病性测定、形态学鉴定及rDNA-ITS序列分析。结果表明，分离到的镰孢菌中有10株为Fusarium commune，分离频率为8.62%。对该10株菌进行致病性测定，均为致病菌株；其中MW4-11菌株致病性最强。该致病菌株的最适生长温度为25～30℃，菌丝致死温度为70℃。选用7种杀菌剂通过平皿培养法对MW4-11菌株进行室内毒力测定。结果表明，75%肟菌·戊唑醇水分散粒剂对该致病菌株的毒性最强，EC50为0.030 μg/mL。

关键词 豇豆； 根腐病； 鐮孢菌； Fusarium commune

中图分类号： S 436.43

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017221

Abstract This paper aims to identify the pathogen of cowpea root rot， and provide reference for the control of the disease. Totally 116 isolates collected from diseased plants in Chengdu City were identified based on pathogenicity test， morphological characteristics and ITS rDNA sequence analysis. Of which 10 isolates belong to Fusarium commune， accounting for 8.62%. Pathogenicity assays indicated that these Fusarium commune isolates were pathogenic to cowpea， and the most pathogenic strain was MW4-11. The mycelial growth test on MW4-11 indicated that the optimal temperature range for the mycelial growth was 25-30℃ and the lethal temperature was 70℃. Toxicities of 7 fungicides were tested by petri dish cultivation method. The results showed that trifloxystrobin · tebuconazole 75% WG had the highest toxicity to F.commune MW4-11， with the EC50 values of 0.030 μg/mL.

Key words cowpea； root rot； Fusarium； Fusarium commune

豇豆Vigna unguiculata （L.） Walp.是我国普遍栽培的蔬菜之一，全国常年栽培面积在33万hm2以上，四川省栽培面积在1万hm2以上[1]。豇豆镰孢型根腐病是重要的土传病害之一，在我国豇豆产区普遍发生，田间病株率为10%～100%。在田间可以与丝核菌根腐病、疫霉根腐病等形成病害复合体，造成更大的危害[2]。

豇豆根腐有镰孢型根腐、疫霉型根腐、腐霉型根腐、丝核菌型根腐等。吴仁峰等分离鉴定湖北武汉地区豇豆根腐病原菌为茄镰孢Fusarium solani[3]；杨玉洁等人认为江苏省如皋市豇豆根腐病原菌主要有茄镰孢F.solani、尖镰孢F.oxysporum和立枯丝核菌Rhizoctonia solani[4]；几内亚、印度、中非、尼日利亚等地的豇豆根腐病病原菌为瓜果腐霉Pythium aphanidermatum和立枯丝核菌Rhizoctonia solani[58]；印度豇豆根腐病病原菌主要为菜豆壳球孢菌Macrophomina phaseolina[9]。目前，还未见Fusarium commune侵染豇豆引起根腐病的报道。镰孢菌能够以厚垣孢子的形式在土壤中存活10年以上，在离开寄主的情况下也能存活5～6年[10]。因此，对该病的防治非常困难。

本研究对引起成都地区豇豆根腐病的病原菌进行分离鉴定，以明确引起成都豇豆根腐病的病原种类，并针对该病菌进行室内防治药剂筛选，旨在为成都地区豇豆根腐病的防治提供参考。

1 材料和方法

1.1 样本来源与病原菌的分离纯化

病样于2016年采自成都市的豇豆主产区。病原真菌的分离方法参照方中达[11]的《植病研究方法》。选取新发病豇豆植株茎基部的根茎作为分离材料，进行常规组织分离，经单孢纯化、培养获得单孢菌株，并于4℃马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）斜面培养基上保存。

1.2 致病性测定

采用Koch’s Rules进行分离菌株的致病性测定。将分离到的菌株用PDA培养基活化，培养5 d后转接到马铃薯葡萄糖液体培养基（PDB）中，于28℃，160 r/min摇床上培养3～5 d，然后将病菌纯培养物（孢子）制成浓度为106～107个/mL悬浮液。采用自然伤根浸根法接种。取生长良好的无病‘赣蔬领袖’豇豆苗（江西金浩种业有限公司生产），用清水将根部表面冲洗干净后将根部完全浸在孢子悬浮液中30 min，接种后的植株定植于装有无菌泥炭土的营养杯中。每个菌株接种10株苗，以清水为对照。植株置于25℃下植物培养箱中，接种后每隔1～2 d观察1次。发病后，从病斑处再次分离病原菌，确认致病菌。

接种15 d后调查豇豆的发病率和病情指数，所得数据用Excel进行汇总，利用SPSS 16.0软件的Duncan法进行差异显著性分析。根据发病率和病情指数挑选致病性强的菌株进行后续试验。

豇豆根腐病分级方法参照国家标准GB/T17980.882004农药田间药效试验准则（二）第88部分《杀菌剂防治大豆根腐病》。

0：植株茎基部和主根均无病斑；

1：茎基部和主根上有少量病斑；

3：茎基部和主根上病斑较多，病斑面积占茎和根总面积的1/4～1/2；

5：茎基部及主根上病斑多且大，病斑面积占茎基部和根部总面积的1/2以上～3/4；

7：茎基部或主根上病斑连片，形成绕茎现象，但根系并未死亡；

9：根系坏死，植株地上部分萎蔫或死亡。

病情指数=∑（各级发病株数×该级代表值）×100/（调查总株数×病情最高级代表值）；

发病率=（发病株数/总株数）×100%。

1.3 病原菌形态学鉴定

将供试的致病菌株接种到PDA培养基上，25℃恒温黑暗培养，72 h后使用十字交叉法测定菌落的生长速率。7 d后观察培养基上的菌落形态特征。在SNA培养基上观察分生孢子梗、大小分生孢子和厚垣孢子的特征，并随机测量20个分生孢子的大小。

根据菌落形态、生长速度和色素颜色，大、小型分生孢子的特征，厚垣孢子有无和着生位置等特征，参照Skovgaard等的报道[12]，并结合Leslie等[13]的镰孢菌实验室手册进行病原菌种的形态学鉴定。

1.4 温度对致病菌株生长的影响

选取致病性强的菌株MW4-11于PDA培养基上25℃培养5 d，用7 mm打孔器在菌落邊缘打取菌饼，接种在PDA培养基上，分别置于5、10、15、20、25、30 、35和40℃培养箱中培养3 d，用十字交叉法测量菌落直径，每个处理重复4次。

1.5 菌丝致死温度测定

选取致病性强的菌株MW4-11于PDA培养基上25℃培养5 d，用7 mm打孔器在菌落边缘打取菌丝块并置于无菌试管中，加入2 mL无菌水。分别在35、40、45、50、55、60、65、70℃水浴锅中处理10 min 后取出迅速冷却，将菌丝块取出置于PDA平板上25℃恒温培养，5 d后观察菌丝生长情况，并用十字交叉法测量菌落直径，每处理重复4次。

1.6 病原菌rDNA-ITS序列分析及系统发育分析

1.6.1 菌丝制备

将保存的菌株接种到PDA培养基上，每皿接种一个菌丝块，于25℃暗培养7 d后用灭菌的载玻片刮取菌丝，并用液氮冷冻研磨成粉，置于-80℃保存，用于基因组DNA提取。

1.6.2 基因组DNA提取

基因组DNA采用改良的CTAB法提取[14]，然后用核糖体内转录间隔区（rDNA-ITS）的通用引物ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG和ITS4：TCC-TCCGCTTATTGATATGC进行PCR扩增，扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

所得扩增产物由上海生工生物工程技术服务有限公司进行双向测序，得到ITS序列，所得序列在GenBank数据库中通过BLAST功能搜索相似度较高的ITS序列。选择测序获得的序列以及GenBank数据库中相关序列，运行Clustal W程序进行序列比对。再运用软件MEGA 6.0，采用最大似然法（Maximum Likelihood）构建系统发育树。

1.7 不同杀菌剂对豇豆根腐病病原菌的室内毒力

1.7.1 供试药剂

75%肟菌·戊唑醇水分散粒剂，德国拜耳作物科学公司；50%醚菌酯水分散粒剂，巴斯夫欧洲公司；50% 烯酰吗啉水分散粒剂，北京达世丰生物科技有限公司；16%二氰·吡唑酯水分散粒剂，巴斯夫欧洲公司；22.5%啶氧菌酯悬浮剂，美国杜邦公司；100 g/L氰霜唑悬浮剂，日本石原产业株式会社；30%噁霉灵水剂，四川国光农化股份有限公司。

1.7.2 含药平板制备

各供试药剂的浓度梯度见表1。浓度1为厂家推荐浓度。先将供试药剂稀释成相应系列浓度的10倍，然后按药液与培养基1∶9的比例，将药液加入到熔化的培养基中，制成含药平板，每个浓度设置4个重复。

1.7.3 测定方法

用打孔器在培养5 d的病原菌菌落边缘打取直径5 mm的菌丝块，分别放在不同药剂平板中央，菌丝面朝下，以加入等量无菌水的培养基作为空白对照；在25℃的恒温培养箱中倒置培养，6 d后用十字交叉法测量菌落直径，计算杀菌剂对菌丝生长的抑制率，并用DPS数据分析软件求EC50，比较供试药剂的毒力大小。

抑制率=（空白对照菌落直径-处理菌落直径）/（空白对照菌落直径-菌饼直径）×100%。

2 结果与分析

2.1 病原菌的分离与培养

从采自成都市豇豆产区的豇豆根腐病样品中共分离到116株镰孢菌，其中有10株初步定为F.commune （菌株编号为：MW4-11，MW4-12， MW1-12，MS1-31，MS1-32，CY28411，CY28412，CY28413，PZ10.11，PZ10.12），分离频率为8.62%。

2.2 致病性测定

用2.1初步确定的10株F.commune的分生孢子悬浮液接种自然伤根的豇豆植株，结果表明，接种后豇豆植株均能发病。发病初期，植株叶片没有明显变化，植株生长缓慢；发病中期植株出现倒伏萎蔫，叶脉黄化，拔出植株，可见其根部自根尖开始发生病变，由侧根延及主根，致整个根系坏死腐烂，并可延及根茎部，对照均不发病（图1）。从病斑处再次分离得到的菌株其性状均与原菌株相同。致病性测定表明（表2）10株F.commune均为致病病原菌，其中MW4-11菌株接种后植株易发病，致病性最强，植株发病率为100%，病情指数为84.57±0.62，显著高于其他分离菌株，因此选取MW4-11菌株作为后续试验菌株。

2.3 病原菌形态特征

选取致病性最强的菌株MW4-11在PDA培养基上培养，25℃恒温黑暗培养72 h菌落直径为4.3 cm。菌落生长较快，气生菌丝发达，为白色绒毛状，培养基背面的色素从无色到乳白色，之后颜色随培养时间的延长变为淡黄色，（图2a～b）。在SNA培养基上，小型分生孢子数量较多，椭圆形至棍棒形，通常无隔膜，大小为（3.5～10.1）μm×（2.2～3.5）μm（图2c）；大型分生孢子较少，细长，梭形两端略弯，有1～3个分隔，3个分隔居多，顶细胞弯曲或收缩变尖，足细胞足形或收缩呈点，大小（22.1～39）μm×（3.5～3.8）μm（图2d）；产孢细胞为短单瓶梗（图2f），偶有较长的单瓶梗（图2e）；厚垣孢子单生（图2g）。参照Skovgaard等[12]的报道，结合Leslie等[13]的分类系统，将该菌鉴定为Fusarium commune。

2.4 温度对MW4-11菌株生长的影响

图3为MW4-11致病菌株在不同温度条件下培养3 d的生长情况，表明菌丝最适生长温度为20～25℃；在10～35℃条件下均可生长，在5℃和40℃条件下几乎不能生长。

2.5 MW4-11致病菌株的致死温度

由菌丝致死温度的测定结果（图4）可知，菌落直径随处理温度升高有降低趋势。65℃及以下水浴处理10 min后的菌丝均能在PDA培养基上再生长，而70℃水浴处理10 min后所有重复处理均无菌丝生长。说明MW4-11菌株致死温度为70℃（10 min）。

2.6 病原菌rDNA-ITS序列分析及系统发育分析

在形态学上，Skovgaard等和Yu等认为Fusarium commune与尖镰孢非常相似很难区分，需用分子生物学技术进行鉴定[12，15]。本文以ITS1（TCCGTAGGTGAACCTGCGG）与ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC）为引物对10株病原菌的ITS区进行扩增，并对ITS区进行双向测序，测序结果与GenBank中核酸数据库进行同源性比较，结果显示10株病原菌的ITS序列与GenBank中的Fusarium commune （GenBank登录号为：KU341323.1， KT98228.1， KU341323.1）的相应片段相似度均达到99%以上，E-value值为0.0。运用MEGA 6.0软件，根据Kimura2-parameter模型，采用最大似然法（Maximum Likelihood）构建系统发育树（图5），bootstrap自展重复1 000次计算系统树种的置信度。结果显示，10株病原菌与F.commune在同一分支上，因此将该10株病原菌鉴定为F.commune。

2.7 杀菌剂毒力测定结果

选取致病性最强的Fusarium commune菌株MW4-11测定供试杀菌剂对其的毒力。据试验结果（表3）可知，7种杀菌剂对MW4-11菌株均有抑制作用。其中75%肟菌·戊唑醇水分散粒剂的抑菌效果最好，最高浓度下抑制率为94.55%，EC50为0.030 μg/mL；30%噁霉灵水剂、16%二氰·吡唑酯水分散粒剂、22.5%啶氧菌酯悬浮剂和50%烯酰吗啉水分散粒剂的抑菌效果次之，最高浓度下抑制率分别为83.21%、80.9%、71.18%、67.99%，EC50分别为19.498、69.158、24.805、79.549 μg/mL； 100 g/L氰霜唑悬浮剂和50%醚菌酯水分散粒剂的抑菌效果差，50%醚菌酯水分散粒剂最高浓度下抑制率仅为49.92%，且EC50高达211.170 μg/mL；虽然100 g/L氰霜唑悬浮剂在最高浓度下抑制率较高，但EC50也最大，为2 059.054 μg/mL。

3 讨论

形态学鉴定和分子鉴定结果表明，分离到的116株镰孢菌中，有10株为Fusarium commune，分离频率为8.62%。致病力测定结果表明，接种MW4-11菌株的豇豆发病率为100%，病情指数为84.57±0.62， MW4-11菌株属于强致病菌。

已有研究表明，镰孢属真菌是引起豇豆根腐病的重要病原菌，其中茄镰孢被认为是豇豆镰孢型根腐的主要病原菌[3，16]，Shrestha等报道层生镰孢也可以引起豇豆根腐[17]；而本研究发现Fusarium commune对豇豆有强的致病力，也能够引发豇豆根腐病。

2003年Skovgaard等首次将Fusarium commune作为一个新种来描述，F.commune的形态特征与F.oxysporum非常相似，而且该菌在2003年之前一直被鉴定为F.oxysporum。这两种菌都能从短的单瓶梗上产生分生孢子，且厚垣孢子为单生或对生。唯一能够区分这两种菌的形态特征是F.commune存在细长的单瓶梗，偶尔会出现多瓶梗[12]。据报道，F.commune能够引起美国白松、黄杉、康乃馨、玉米、胡萝卜、大麦和山葵根腐病[12，15]，也能够引起番茄的冠腐病和根腐病[18]。Fusarium commune作为豇豆根腐病的病原菌是首次报道。

本试验对引起豇豆根腐病的病原菌MW4-11菌株进行最适生长温度和致死温度的研究，结果表明，该菌最适生长温度为20～25℃，在5℃以下、40℃以上几乎不生长，该菌生长规律与尖镰孢大体一致[19]。该菌菌丝致死温度为70℃（10 min），郑莉等报道草莓枯萎病菌Fusarium oxysporum Schl.菌丝生长的致死温度为65℃（10 min）[20]，賀春萍等研究发现，西瓜尖镰孢Fusarium oxysporum f.sp.niveum（E. F Smith）Snyder & Hansen菌丝的致死温度为80℃（10 min）[21]。说明Fusarium commune 与尖镰孢以及尖镰孢不同专化型之间菌丝生长对温度的敏感性存在差异。

为了筛选抑制Fusarium commune生长的化学药剂，为防治Fusarium commune引起的根腐病提供依据，我们测定了7种杀菌剂对MW4-11菌株的室内毒力，结果（表3）表明，75%肟菌·戊唑醇水分散粒剂对该病菌菌丝生长的抑菌效果最好，最高浓度下抑制率为94.55%，EC50为0.030 μg/mL，其次为30%噁霉灵水剂、16%二氰·吡唑酯水分散粒剂、22.5%啶氧菌酯悬浮剂、50%烯酰吗啉水分散粒剂，它们均可作为豇豆根腐病防治的候选药剂。豇豆根腐病的传统防治药剂为噁霉灵，而本研究结果表明，75%肟菌·戊唑醇水分散粒剂对豇豆根腐病病原菌的生长抑制效果好于30%噁霉灵水剂；22.5%啶氧菌酯悬浮剂对豇豆根腐病病原菌的生长抑制效果与30%噁霉灵水剂的相当。本研究拓宽了防治豇豆根腐病的药剂选择范围，为豇豆根腐病的防治提供了科学依据。

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（责任编辑：杨明丽）

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