分析方法开发,化合物特性参数pKa,LogP,LogD与分离保留关系
时间：2020-08-25 来源：博通范文网 本文已影响 人 
中性化合物由于其疏水性，借助反相色谱法（RPC）即可分离。酸碱化合物的分析分离在较早前使用离子交换色谱方法，现在常用 RPC 方法即可分离分子量<1000 Da 的酸碱化合物。大多数小分子药物或者候选化合物是酸性或碱性化合物，它们常带有各种官能团，如羟基、羰基、氨基、羧基、硝基，卤素等。这些化合物的在 RPC 中的保留与流动相的 pH 值有密切的关系。
1 化合物 pKa 在方法建立选择流动相的 pH 范围时，了解化合物的 pKa 参数非常关键。
对于酸性化合物：HA→A - +H +
对于碱性化合物：B+H + →BH +
化合物酸碱电离常数（pKa）代表着化合物的酸碱性，预示着它的色谱保留会受到它的电离程度的影响。一般离子化程度越高，在反相上的保留越弱，在中性状态上保留最强。化合物的离子化取决于流动相 pH 和它的 pKa。
化合物的保留与离子化程度的函数关系如下：
k 0 表示化合物呈分子态的保留，k 1 表示去质子化（离子化）时的保留，d 代表分子的离子化比例（0≤d≤1）。
当 pH=pKa 时，表示化合物离子化比例为 50%。
图 图 1
酸碱化合物离子化、pH 、pKa 和保留 k 的模拟关系
上图 1 模拟了化合物离子化程度、流动相 pH 和保留因子 k 之间的曲线关系。
酸性化合物 HA 的 pKa 为 5，当流动相 pH=5 时，它离子化 50%，曲线中处在斜率最大的区域，改变流动相 pH 值可以最大化改变它的 k 值；同理，碱性化合物 B 的 pKa 为 10，当流动相 pH=10 时，它离子化 50%，曲线中处在斜率最大的区域，改变流动相 pH 值也可以最大化改变它的 k 值，因此调节流动相 pH 可以优化色谱的选择性和分离度。当流动相的 pH 值等于化合物的 pKa 时，此时可以最大效应的调节它的保留时间和分离度。
图 图 2
保留时间与 pH 之间的关系
如图 2，当酸或碱的离子化比例为 50%时，改变 0.1 个 pH 单位，k 值发生 10%的变化，从而引起分离度 2.5 个单位的变动。意味着，为避免 pH 对保留行为的影响，所选流动相的 pH最好与样品 pKa 有 1.5 个单位的差异。
常见化合物的 pKa 值可以通过查询相关数据库或者软件预测得到。如 www.chemspider.com数据库，或 www.drugbank.com 数据库。在不能查询得到的情况一下，一些化学软件如 ACD labs 或者 Drylab 可以对化合物的 pKa 进行预测。
在色谱方法开发时，对于化合物 pKa 值的获取并不要求十分准确，通过它的酸碱基团可以计算得到。表 1 为常见基团的 pKa 值估算。
比如苯甲酸，它的 pKa 软件预测为 4.1，通过表 1 可得到芳香族羧酸为 4.0，结果接近。比如苯乙胺，软件预测 pKa 为 9.3，表 1 得到近似值 10.0。苯胺，软件预测 pKa 为 4.6，通过表1 得到近似值 5.0。
表 表 1
酸碱官能团在水溶液中的 pKa 近似值 2 化合物 LogP 和 LogD LogP 是化合物的油水分配系数，常用于表征药物在体内溶解、吸收、分布和转运的水溶性和脂溶性。在分析方法开发时，了解化合物的 LogP，有助于理解它的疏水性。
化合物 LogP 的测定，是中性条件下化合物在正辛醇和水溶液中的分配系数比值的对数值。在 RPC 中，流动相的 pH 值在 1-12 都有可能。不同 pH 值条件下化合物的电离基团是变动的，其真实的疏水性也在动态变化。在分析方法开发时只了解化合物的 LogP 是有局限性的，因此引入 LogD，它代表在不同 pH 的条件下，化合物在正辛醇和水溶液中的分配系数比值的对数值。LogD 能够真实反应目标化合物在不同 pH 条件下的疏水性。
疏水性是化合物在色谱柱上分离的重要影响因素。
色谱柱的选择性差异是化合物被分离的重要前提。基于色谱柱的选择性，施耐德等人提出了色谱柱对溶质保留的疏水减法模型：
模型的左侧表征溶质分子的保留情况，kEB 表示只有疏水相互作用的乙苯的保留。右侧的各项分别表征疏水相互作用（Ƞ’H 项），分子的形状大小因素（δ’S 项），相互间的氢键作用（β’A+ɑ’B 项），相互间的离子交换作用（κ’C 项）。每一项希腊字母代表的是溶质分子的相关能力，每一项英文字母代表的是色谱柱的相关能力。
logD 与 Ƞ’H 中的 Ƞ’有关，表示化合物疏水作用，pKa 与κ’C 中κ’相关，表示化合物电离作用。
对于常见中性化合物，在不同 pH 值条件下不发生电离，它在色谱柱上的保留是规则性的，主要由其疏水性大小决定，比较它们的 LogP 即可预测化合物的先后保留行为。
对于常见酸碱电离化合物，在色谱柱上的保留是不规则的，除与氢键有关外，它与 pKa 和 logD有着重要关系。它的保留随着流动相 pH 值改变而改变，这个时候比较它们在不同 pH 值下的LogD 可以帮助预测化合物的保留行为，从而达到分离的效果。
对于结构偏大，存在复杂构象，氢键丰富，电荷丰富的化合物，如万古霉素，使用单个的LogP/LogD 参数,、pKa 的特性，很难预测它的保留行为，这个时候施耐德疏水减法模型需要全部考虑进去。
LogD 可以认为是 pKa、LogP 两个参数的综合性参数，理解和掌握这个参数对反相色谱方法开发的研究非常重要。在色谱方法开发阶段，可以将所有已知结构物质的 LogD 曲线绘制在一张图上来近似了解和选择适宜的 pH 范围。
图 图 3
多个药物分子的 LogD 曲线堆叠图 3
缓冲液 pKa 缓冲液是指一种共轭的质子给体和质子受体构成的离子化合物的溶液，它可以在加入少量的酸或碱时维持溶液 pH 值的稳定。常见缓冲液的 pKa 如表 2。
表 表 2
常见 HPLC 缓冲液的 pKa 列表
当缓冲溶液中容质的两种状态（离子态和分子态）浓度相等时，即缓冲液 pKa 等于溶液 pH时，缓冲能力最大。溶液 pH 值离缓冲液的 pKa 越远，其缓冲能力越小。因此流动相 pH 值最好在缓冲液 pKa±1.0 范围内，这个时候的缓冲能力最强。
当缓冲液的缓冲能力不足时，易导致容质峰拖尾。增加流动相的缓冲能力可以通过，扩大流动相 pH 和溶质 pKa 之间的差异、增加缓冲液浓度、减少样品进样体积、调节样品溶液 pH值与流动相一致性来实现。
下图 4 为 3,5-二甲基苯胺，在不同 pH 磷酸氢二钾缓冲溶液中的色谱峰形。化合物 pKa 为 3.8，缓冲溶液 pH 为 4.0 时的缓冲能力最差，前沿峰严重；pH 降低至 3.0 时，远离化合物化合物
pKa，同时接近缓冲液 pKa，溶液缓冲能力增强，峰形逐渐正常。上述现象是由于缓冲液的缓冲能力强弱导致。
图 图 4
缓冲能力不对对峰形影响 4 有机溶剂和温度对流动相 pH 和化合物 pKa 的影响 对于溶质和缓冲液均为酸或碱的情况下，有机溶剂比例变化对它们的影响是一样的，可以忽略不计；当溶质为酸，缓冲液为碱，或者相反时，有机溶剂比例变化对于流动相 pH 和溶质 pKa的影响是不同的。
对于乙腈，比例每改变 10%，pH 的校正因子为 0.2 个单位；对于甲醇，比例每改变 10%，pH 校正因子为 0.1 个单位。
a. 假如缓冲液和分析物都是酸性或碱性，有机相的加入对 pH 和 pKa 的影响会很大程度抵消掉，总的校正因子约为 0；此时，可以直接根据分析物的 pKa 来确定配置的缓冲液的 pH。
b. 假如缓冲液和分析物的酸碱性不一致，即一个是酸性另一个是碱性，加入有机相时影响会非常大。有机相比例在 0-60%的范围内，总的校正因子为对于乙腈，比例每改变 10%，校正因子为 0.4 个单位，即对于酸性分析物 pH 校正因子为+0.4 个单位，对于碱为-0.4 个单位；对于甲醇，比例每改变 10%，校正因子为 0.2 个单位，即对于酸性分析物 pH 校正因子为+0.2个单位，对于碱为-0.2 个单位，如表 3。
表 表 3
有机相为乙腈时，当分析物和缓冲液酸碱性不一致时的校正因子数据
温度的变化对于缓冲液和样品的 pKa 也会有影响。对于质子化碱，提高温度会降低有效 pKa值。温度对于离子化合物的 pKa 影响要大于中性化合物，但由于柱温一般是在 30-50℃，温度的改变对于化合物的 pKa 的变动影响小，因此，建立方法时可以忽略温度对 pKa 的影响。
5 结束语 分析方法开发时，了解化合物的特性参数（pKa，LogP，LogD）和缓冲液的 pKa 非常重要，它可以帮助分析工作者减少试错的时间和物质成本。在前期分析方法开发设计时，掌握化合物特性参数，对于色谱柱的选择，缓冲盐类型的选择，流动相 pH 值的选择，都有着参考和借鉴意义，它属于分析方法知识管理的一部分。
6 参考文献
1．现代液相色谱技术导论，陈小明等
2．从 pKa 到流动相 pH 的科学选择(三)：确定合适的流动相 pH，爱色谱
3. 软件辅助液相色谱分析方法开发的经验，阎作伟，同写意
