肿瘤基因靶向治疗中的启动子研究

[摘要] 利用肿瘤特异性启动子调控治疗基因在肿瘤细胞中的表达，是实现肿瘤靶向性基因治疗以及提高转导效率的重要手段和有效途径。肿瘤特异性启动子可耦联溶瘤基因、抑癌基因、自杀基因以及siRNA/MicRNA等，特异性调控这些基因在肿瘤治疗中杀死或诱导癌细胞凋亡，或抑制其生长，而对正常细胞影响非常小，从而达到特异性治疗的目的。

[关键词] 基因治疗；肿瘤；特异性启动子；靶向治疗

[中图分类号] R730.5   [文献标识码] A   [文章编号] 2095-0616（2012）05-49-03

Study on specific promoters for tumor target gene therapy

GUO Longjiang  WU Yaqing

Institute of Molecular Medicine, Huaqiao University Engineering Research Center of Molecular Medicine, Ministry of Education, Quanzhou 362021,China

[Abstract] By using the tumor specific promoter to regulate related gene expression at tumor cell is one of the best approaches to achieve tumor targeting gene therapy and improve transduction efficiency. TSP could be coupled with oncolytic,tumor suppressor genes,antisense nucleic acids,suicide gene and siRNA/ MicRMA etc,then specific regulate them to induce the apoptosis of tumor cells, kill them directly,or inhibit their proliferation without toxicity to normal cells.

[Key words] Gene therapy;Tumor;Specific promoters;Targeted therapy

研究证明，通过基因转移的靶向性、突变基因的原位修复、基因表达的时相性、基因表达的靶向性等调控手段，可解决基因治疗的靶向性和安全性不足的问题[1]。肿瘤特异性启动子（tumor specific promoter，TSP）可特异地调控靶基因在癌细胞中表达，增强靶基因的表达效率和特异性，从而提高癌基因治疗的靶向性和安全性。

1 启动子的概念及研究意义

运用特定的基因表达调控元件，使目的基因特异地在肿瘤细胞中表达，从而避免对正常细胞的损伤，是实现肿瘤基因治疗靶向性的重要手段之一[2]。启动子是遗传区域的上游调控单元，每个基因在5’磷酸末端具有一个启动序列作为转录起始位点，它是结合RNA聚合酶启动mRNA转录的重要条件之一。研究表明，启动子需要由特定的转录因子激活才能具有活性，启动子具有组织特异性调控功能。pGL6-Basic为无启动子的含有虫荧光素酶（luciferase，Luc）报告基因的质粒，pRL-tk为含有tk启动子调控的海洋腔肠荧光素酶（Renillaluciferase， RL）报告基因的质粒，在pGL6-Basic基础上重组目的启动子序列后，与pRL-tk共转染靶细胞后，然后用双荧光检测系统测定转染细胞裂解液中Luc和RL活性，后者的活性反映每孔细胞的转染效率，Luc/RL的比值则可反映目的启动子的相对活性。

2 肿瘤特异启动子

2.1 人端粒酶逆转录酶启动子（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）

hTERT蛋白在90%以上的肿瘤组织中表达升高，而在正常组织中却很难检测到，与其他启动子相比，hTERT更具广谱性和安全性。端粒酶在几乎所有的人类肿瘤细胞中具有高活性，因此很早就有研究者用hTERT启动子取代控制腺病毒复制必需基因E1A的启动子来调控病毒在体内特异性复制，从而达到靶向治疗的目的[3]。最近Crystal等[4]利用hTERT启动子偶联吲哚-3-甲醇的端粒酶基因阻滞人类乳腺癌细胞的G1期细胞周期。Jessica等[5]利用hTERT启动子调控新型腺病毒装载的GFP-TRAIL融合蛋白表达，靶向不同人类脑膜瘤和胶质瘤细胞，从而起到了靶向治疗的效果。

2.2 凋亡抑制蛋白（survivin）

Survivin是凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein，IAP）家族的成员，同样在众多肿瘤检测到高表达。Yuh-Pyng等利用survivin启动子调节BikDD基因靶向抑制了原位肺癌细胞的生长，延长了实验动物生存期，实验证明这一方案是高效且安全的，具有肺癌临床治疗前景。

2.3 甲胎蛋白启动子（alpha-fetoprotein，AFP）

AFP是肿瘤标志物，正常时由卵黄囊及胚胎肝产生，出生1年后维持低水平，肝病时升高，明显增高见于肝细胞性肝癌和畸胎瘤，70%的肝癌患者血清中此种蛋白质的水平升高。利用AFP启动子介导tBid协同化疗药物（5-氟脲嘧啶）对小鼠原位肝肿瘤模型进行试验，发现Ad/AFPtBid能够抑制Hep3B肿瘤生长，而与5-氟脲嘧啶联合用药则效果更加明显[6]。同时Cao等[7]利用AFP启动子与E1A启动子结合调控携带TRAIL基因的溶瘤腺病毒表达，实现了体内肝癌基因靶向治疗，从而证明AFP在癌基因治疗中特异性启动子的应用前景。

2.4 神经元特异性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）

NSE是烯醇化酶的一种同功酶，目前，NSE被公认为人小细胞肺癌（human small cell lung carcinoma cells，SCLC）的最有价值的肿瘤标志物之一[8]。Xu等分别对不同长度NSE启动子在神经胶质瘤细胞中活性进行定量研究，发现1.8 kb的NSE具有最高活性。应用HSV-TK/GCV自杀基因系统，Tanaka等证明了NSE启动子在人小细胞肺癌具有高调控活性，利用单纯疱疹病毒Ⅰ型胸腺嘧啶核苷激酶（HSV1-TK）基因/丙氧鸟（GCV）系统，其通过调节单纯疱疹病毒胸苷激酶表达将抗病毒核酸类似物前药GCV磷酸化，从而抑制DNA合成、导致细胞死亡。

2.5 骨钙素（osteocalcin，OC）

OC是一种由成骨细胞合成的非胶原蛋白，文献证明在原发性骨肉瘤、软骨肉瘤中广泛表达。Johnson等[9]报道OC启动子通过维生素C和D3协同作用诱导，可以靶向不同类型的肾细胞癌基因治疗。Shirakawa T等报道OC启动子和PSA启动子在雄性激素阴性和阳性前列腺癌细胞中均具有高活性，能够调控毒性基因杀死前列腺癌细胞。

2.6 其他

深入地研究肿瘤特异启动子，越来越多的肿瘤特异性标志物基因启动子被证明具有特异性及高效性。癌胚抗原（CEA）启动子可控制或增强融合自杀基因单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSVTK）在CEA阳性癌细胞中的专一性表达和杀伤作用[10]；insulinoma associated 1（INSM1）是一类含有锌指结构的转录因子，INSM1启动子可靶向小细胞肺癌[11]；毛细血管扩张性共济失调症突变蛋白（ataxia telang-iectasia mutated，ATM）是一种激酶，Palmieri等[12]报道高迁移率族蛋白A可促进ATM启动子活性，从而达到高效特异启动子的目的。此外还有环氧合酶（Cox-2）、分泌白细胞蛋白酶抑制剂（SLPI）、转录因子家族成员E2F启动子等都是近年来新发现的具有肿瘤特异性启动子[13]。

3 肿瘤启动子优化及应用

3.1 启动子优化

研究发现肿瘤特异性启动子仍然存在着许多不足，例如某些启动子虽然具备特异性，但活性太低，而某些启动子虽然活性高却是广谱的，缺乏安全性，所以需要对启动子进行优化和改造，提高其使用价值。启动子核酸序列的长短是优化手段之一，活性越高，碱基长度越短的启动子更具使用价值，Xu等研究NSE启动子时，发现NSE启动子时，就NSE不同长度的序列活性进行对比，最终发现1.8 kb的NSE具有最高活性。其二在原有启动子序列上增加调控元件，例如将增强子重组到特异性启动子表达载体中以增加启动子在肿瘤中的活性[14]。在PSA启动子上添加增强子明显提高了其调控的绿色荧光蛋白在前列腺癌中的表达效率。嵌合启动子是启动子优化的重要手段之一，研究表明嵌合启动子能够弥补单一启动子特异性及安全性方面的不足。hTERT启动子和缺氧敏感的缺氧诱导因子（hypoxia-inducible factor，HIF）启动子嵌合，可调控装载有SEA基因的腺病毒靶向治疗膀胱癌[15]。Takuya等提出TTS启动子系统，将hTERT启动子和人肺表面活性物质相关蛋白（human surfactant protein A1）嵌合，发现相对于别的癌细胞以及正常细胞，TTS在肺癌中具有明显的高效性及特异性。随后Takuya在原有的TTS系统上插入Bid构建TTS/Bid系统，证明了TTS对癌细胞的具有明显的杀伤效应 [16]。IGF2-P4启动子和H19启动子组合在癌细胞中也表现出高活性，随后作者又证明了IGF2-P3和IGF2-P4启动子组合具有膀胱癌特异性[17-18]。借助放射线照射、肿瘤局部的缺氧、四环素等一些外在因素也可以优化启动子，提高其活性。

3.2 启动子的应用

抗肿瘤效应则是由病毒复制产生，因此复制必须在肿瘤细胞，以保护正常细胞不被损坏。肿瘤特异性启动子是一种高效的工具用于减少肿瘤基因治疗中对正常组织的损害，已有众多研究将启动子用于特异性突变或者递送前药酶基因的表达调控，并取得了很好的效果。Udono等[19]利用特异性启动子hTERT构建了肿瘤特异性条件复制病毒表达系统，用于癌症靶向治疗。肿瘤特异性启动子可用于递送前药酶，如HER-2启动子可调控HSV-TK/GCV自杀基因系统杀伤前列腺癌细胞[20]。通过RNAi技术调节与肿瘤发生发展相关基因的表达可制定出一系列有效的抗癌策略，应用肿瘤特异性启动子如HRAS启动子引导针对某些癌基因或抗凋亡分子的siRNA或短发夹（shRNA）表达，从而达到特异性杀伤肿瘤细胞的目的[21]。将启动子构建到携带有治疗基因如细菌毒素基因、用于基因治疗的细胞因子、凋亡基因TRAIL等的载体上，直接调控治疗基因的表达是启动子应用最直接的方法。

肿瘤特异性启动子研究，为肿瘤基因治疗效率及安全性问题开辟了一个新的有效研发途径，但是肿瘤特异性启动子仍然存在着许多不足，特异性和高效性尚未得到彻底的解决，人工启动子是否具有潜在危险性有待进一步验证，启动子的优化和修饰比较繁琐，技术条件要求高，迄今为止还没有一个行之有效的方案供人们参考，目前的方案还有待完善。在肿瘤特异性启动子研究中需要寻找新的效果更为显著肿瘤特异性启动子，探索更有效的启动优化方案及更有临床前景的启动子应用方法。

[参考文献]

[1] 张景迎，陈诗书.肿瘤基因治疗的靶向性研究[J].肿瘤，1999，2：19.

[2] Lo HW，Day CP，Hung MC.Cancer-specific gene therapy[J].Adv Genet，2005，54：235-255.

[3] Kim NW，Piatyszek MA，Prowse KR，et al.Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer[J].Science，1994，266 （5193）：2011-2015.

[4] Crystal N，Shyam N，Min Tseng，et al.Indole-3-carbinol dowegulation of telomerase gene expression requires the inhibition of estrogen receptor-alpha and Sp1 transcription factor interactions within the hTERT promoter and mediates the G1 cell cycle arrest of human breast cancer cells[J].Carcinogenesis，2011，32（9）：1315-1323.

[5] Jessica T，Ka Bian，Alan L，et al.Targeting different types of human meningioma and glioma cells using a novel adenoviral vector expressing GFP-TRAIL fusion protein from hTERT promoter[J].Cancer Cell International，2011，28（1）：35.

[6] Ma SH，Chen GG，Yip J，et al.Therapeutic effect of alpha-fetoprotein promoter-mediated tBid and chemo- therapeutic agents on orthotopic liver tumor in mice[J].Gene Ther，2010，17（7）：905-912.

[7] Cao X，Yang M，Wei RC，et al.Cancer targeting Gene-Viro-Therapy of liver carcinoma by dual-regulated oncolytic adenovirus armed with TRAIL gene[J].Gene Therapy 2011，18（8）：765-777.

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[8] Alissa K.Greenberga and M et al. Biomarkers for lung cancer：clinical uses[J].Curr Opin Pulm Med， 2007，13（4）：249-255.

[9] Johnson NA，Chen BH，Sung SY，et al.A novel targeting modality for renal cell carcinoma： human osteocalcin promoter-mediated gene therapy synergistically induced by vitamin C and vitamin D3[J].J Gene Med，2010， 12（11）：892-903.

[10] Qiao J，Doubrovin M，Sauter BV，et al.Tumor-specific transcriptional targeting of suicide gene therapy [J].Gene Ther，2002，9（3）：168-175.

[11] Christensen CL，Gjetting T，Poulsen TT，et al.Targeted cytosine deaminase-uracil phosphoribosyl transferase suicide gene therapy induces small cell lung cancer-specific cytotoxicity and tumor growth delay[J].Clin Cancer Res，2010，16（8）：2308-2319.

[12] Palmieri D，Valentino T，D’Angelo1，et al.HMGA proteins promote ATM expression and enhance cancer cell resistance to genotoxic agents[J].Oncogene，2011，30（27）：3024-3035.

[13] Othman EE，Zhu ZB，Curiel DT，et al.Toward gene therapy of endometriosis： transductional and transcrip- tional targeting of adenoviral vectors to endometriosis cells[J].Am J Obstet Gynecol，2008，199（2）：117.

[14] Xie X，Hsu JL，Choi MG，et al.A novel hTERT promoter-driven E1A therapeutic for ovarian cancer [J]. Mol Cancer Ther，2009，8（8）：2375-2382.

[15] Hu J，Xuan X，Han C，et al.Anti-tumor function of double-promoter regulated adenovirus carrying SEA gene， in the treatment of bladder cancer[J].Cell Biochem Biophys，2012，6（22）：353-359.

[16] Fukazawa T，Maeda Y，Matsuoka J，et al.Drug-regulatable cancer cell death induced by BID under control of the tissue-specific，lung cancer-targeted TTS promoter system[J].Int J Cancer，2009，125（8）：1975-1984.

[17] Amit D，Hochberg A.Development of targeted therapy for bladder cancer mediated by a double promoter plasmid expressing diphtheria toxin under the control of H19 and IGF2-P4 regulatory sequences [J].J Transl Med，2010，16（8）：134.

[18] Amit D，Tamir S，Birman T，et al.Development of targeted therapy for bladder cancer mediated by a double promoter plasmid expressing diphtheria toxin under the control of IGF2-P3 and IGF2-P4 regulatory sequences[J].Int J Clin Exp Med，2011，4（2）：91-102.

[19] Udono M，Fujiki T，Yamashita M，et al.Construction of a regulatable cancer-specific adenoviral expression system using human telomerase reverse transcriptase genepromoter[J].Biosci Biotechnol Biochem，2008，72（6）：1638-1641.

[20] Zhang KX，Jia W，Rennie PS.Bioengineered viral vectors for targeting and killing prostate cancer cells [J].Bioeng Bugs，2010，1（2）：92-96.

[21] Membrino A，Cogoi S，Pedersen EB，et al.G4-DNA formation in the HRAS promoter and rational design of decoy oligonucleotides for cancer therapy[J].Plos One，2011，6（9）：e24421.

（收稿日期：2012-03-01）

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